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유전 공학 방법을 기반으로 한 인슐린 생산

인슐린은 탄수화물 대사를 조절하고 정상적인 혈당 수치를 유지하는 췌장 호르몬입니다. 신체 에이 호르몬이 부족하면 가장 심각한 질병 중 하나 인 당뇨병으로 이어지며, 이는 사망 원인으로 심혈관 질환 및 암 다음으로 3 위를 차지합니다..

인슐린은 51 개의 아미노산 잔기를 포함하고 두 개의 이황화 다리로 연결된 두 개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 작은 구형 단백질입니다.

1- 단일 사슬 전구체로 합성됩니다-preproinsulin (106 a / c)

2- 신호 펩티드가 제거되면 세포에 86 개 아미노산 잔기의 프로 인슐린 화가 형성되며, 여기서 인슐린의 A 및 B 사슬은 C- 펩티드로 연결되어 이황화 결합을 닫을 때 필요한 방향을 제공합니다..

3- C- 펩티드의 단백질 분해 절단 후 인슐린이 형성됩니다. (51)

여러 형태의 당뇨병이 알려져 있습니다. 환자에게 인슐린이 필요한 치료를위한 가장 심각한 형태 (인슐린 의존형 질병)는이 호르몬을 합성하는 세포 (췌장의 랑게르한스 섬 세포)의 선택적 사멸로 인해 발생합니다. 치료를 위해 인슐린을 필요로하지 않는 당뇨병의 한 형태가 더 일반적이며 적절한식이 요법과 요법으로 관리 할 수 ​​있습니다. 일반적으로 소와 돼지의 췌장은 육류 및 통조림 산업에서 사용되지 않으며 냉장 자동차로 제약 회사에 공급되어 호르몬이 추출됩니다. 100g의 결정 성 인슐린을 얻으려면 800-1000kg의 원료가 필요합니다.

1980 년 덴마크 회사 Novo Indadri는 B 사슬의 30 번째 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 대체하여 돼지 인슐린을 인간 인슐린으로 전환하는 방법을 개발했습니다. 두 인슐린 모두 활성과 작용 기간이 다르지 않았습니다..

유전자 조작 인슐린 생산에 대한 연구는 약 20 년 전에 시작되었습니다. 1978 년 랫트 프로 인슐린 (미국)을 생산하는 대장균 균주를 받았다는 메시지가있었습니다. 같은 해, 대장균 세포에서 합성 유전자의 발현을 통해 인간 인슐린의 개별 사슬이 합성되었습니다.

얻어진 합성 유전자를 프로모터를 포함하는 천연 DNA 단편과 대장균 P- 갈 락토시다 아제 단백질 유전자의 근위부를 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 pEk를 대장균 세포로 형질 전환시켰다. 삽입 된 유전자의 발현 결과, 박테리아는 영역 (N- 말단에 3- 갈 락토시다 아제, C- 말단에 뉴로 펩티드 서열)을 포함하는 융합 (키메라) 단백질을 생성하기 시작했다. 사이 아노 겐 브로마이드를 사용하여 키메라 단백질을 체외에서 분해하여 활성 류신-엔케팔린을 얻었다. 그림 1. 합성 류신-엔케팔린 유전자의 클로닝 방식과 대장균 세포에서의 발현.

비슷한 방법으로 시상 하부의 호르몬 인 소마토스타틴을 합성했다 (그림 2). 소마토스타틴 분자는 14 개의 아미노산 잔기로 구성됩니다. 소마토스타틴은 인슐린과 인간 성장 호르몬의 방출을 억제합니다.

추가 날짜 : 2015-06-25; 조회 수 : 5561; 저작권 침해?

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당뇨병 치료를위한 인슐린을 얻는 현대 기술

당뇨병 (DM)은 가장 강력하고 널리 퍼진 대사 질환 중 하나입니다. 통계에 따르면 10-15 년마다 전 세계 당뇨병 환자 수가 두 배로 증가합니다..

이 질병은 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다. 환자는 지속적으로 구강 건조와 갈증을 경험하므로 많은 양의 수분을 섭취해야합니다. 결과적으로 빈번하고 많은 배뇨가 발생합니다. 그 사람은 식욕이 증가합니다. 피부가 건조 해지고 농포가 나타납니다. 종아리 근육 경련이 흔합니다..

시간이 지남에 따라 심장 및 혈관, 말초 신경, 망막, 신장에 손상이 발생하고 영양성 궤양 (당뇨병 성 발)의 형성, 당뇨병 성 혼수 상태에 빠질 위험이 급격히 증가합니다..

질병의 종류와 원인

SD는 두 가지 주요 유형입니다.

  • 첫번째,
  • 둘째.

첫 번째 유형은 어린 나이 (최대 30 세)에 가장 자주 발생합니다. 이는 췌장 (PZh)에서 생성되는 인슐린 호르몬의 불충분 한 분비와 관련이 있습니다. 호르몬 생산의 감소는 췌장의 랑게르한스 섬의 β 세포 손상으로 인해 발생합니다. 특정 바이러스 감염 (간염, 풍진, 유행성 이하선염)에 대한 신체의자가 면역 반응이나 살충제, 니트로사민, 약물 등의 독성 영향으로 인해 손상됩니다..

제 2 형 당뇨병은 보통 40 세 이후에 시작됩니다. 이 경우 혈액 내 호르몬 수치는 정상이거나 정상을 초과 할 수 있지만 신체 세포는 면역성이있는 것으로 판명됩니다. 제 2 형 당뇨병에는 여러 가지 이유가 있습니다 (유전성 소인, 비만, 만성 스트레스, 체계적인식이 장애 등)..

두 유형의 당뇨병 모두 혈액에서 높은 포도당 수치가 진단됩니다..

치료

현대 의학은 당뇨병을 치료하는 방법을 모르기 때문에이 만성 질환은 평생 치료해야합니다. 지지 요법은 두 가지 주요 영역에서 수행됩니다.

  • 혈당 증가를 목표로 한 식단 준수,
  • 탄수화물 대사를 조절하기 위해 호르몬이나 설탕을 낮추는 약물 복용.

제 1 형 당뇨병은 인슐린 의존성이라고하며 인슐린 요법은 필수 불가결합니다..

두 번째 경우 (비 인슐린 의존성 당뇨병)의 경우 주요 강조점은식이 요법과 설탕을 낮추는 약물 복용입니다. 인슐린 요법은 설탕 수치를 낮추는 약물의 사용이 효과가 없을 때 처방되며 케톤 산증의 발병 및 혼수 상태 전 상태입니다. 인슐린 요법은 병리가 동반되는 경우에도 수행됩니다 (간 및 신부전, 결핵, 만성 신우 신염).

인슐린 받기

그것은 펩티드 성격의 인슐린 호르몬입니다. 분자는 두 개의 폴리펩티드 사슬로 형성됩니다. 첫 번째 (A)는 21 개의 아미노산 잔기, 두 번째 (B)-30 개의 잔기를 포함합니다. 사슬은 두 개의 이황화 다리로 서로 연결되어 있습니다..

호르몬의 주요 역할은 탄수화물 대사를 조절하는 것입니다. 호르몬은 세포막을 통한 포도당의 전이와 조직에서의 사용을 향상시키고 간에서 글리코겐으로의 변환을 촉진합니다. 또한 글리코겐이 포도당으로 분해되고 아미노산과 지방산에서 합성되는 것을 억제합니다..

탄수화물 외에도 호르몬은 단백질과 지방 대사에 관여합니다.

인류 역사상 처음으로 그들은 1922 년에 송아지 췌장에서 분리 된 호르몬으로 당뇨병을 치료하려고했습니다. 두 번째 시도에서 실험이 성공했습니다..

현재 당뇨병 환자를위한 약물의 산업적 생산에는 두 가지 방법이 있습니다.

  • 돼지 인슐린의 효소 처리,
  • 유전 공학.

돼지 호르몬은 인간과 하나의 아미노산 만 다릅니다. 트레오닌 대신 알라닌이 존재합니다. 따라서 인간 구조를 부여하기 위해 동물 원료의 화학적 변형이 수행됩니다. 화학 반응 과정에서 알라닌이 절단되고 트레오닌이 추가됩니다.

유전자 조작 방법으로 유전자 변형 미생물 (박테리아, 효모)을 사용하여 제품을 방출합니다. 유사한 인슐린을 생산하는 데는 두 가지 옵션이 있습니다..

  1. 첫 번째 옵션은 두 가지 미생물 균주를 사용하는 것입니다. 각 균주는 DNA 분자의 한 가닥을 합성합니다. 그런 다음 두 사슬이 연결되고 그 후에 활성 형태의 인슐린이 용액에서 방출됩니다..
  2. 두 번째 옵션의 핵심은 미생물이 먼저 프로 인슐린을 생성한다는 것입니다. 효소 처리 후 프로 인슐린은 활성 호르몬으로 전환됩니다..

인슐린 제제는 적절하게 정제되지 않은 경우 원하지 않는 부작용을 유발할 수있는 다양한 불순물을 포함 할 수 있습니다..

이러한 불순물에는 프로 인슐린, 단백질, 글루카곤 등이 포함됩니다. 현대의 정제 기술은이를 준수하여 정제 된 (단일 피크) 및 고순도 (단일 성분, 결정화 된) 인슐린을 생산할 수 있습니다..

노출 분류 기간

이 기준에 따라 인슐린 제제는 구별됩니다.

극초 단 동작 (UKD),

  • 짧은 CD),
  • 중간 (SD),
  • 장기 (DD),
  • 결합 된 행동.

아시다시피 인슐린 분비는 정상적으로 다릅니다. 낮에는 고르지 않게 생산됩니다. 배경 (기초)과 자극 된 호르몬 생성을 구분합니다. 기저는 포도당 섭취와 같은 호르몬 방출에 대한 외부 자극의 영향없이 체내에 존재하는 것입니다. 그 역할은 다음을 줄이는 것입니다.

  • 간에서 포도당의 기초 방출,
  • 금식 설탕,
  • 유리 지방산 수준.

약물 KD와 UKD는 외부 자극에 반응하여 췌장에서 분비되는 인슐린을 대체합니다. 약물 DM 및 DD는 배경 분비를 생성합니다. 결합 된 공식은 두 작용을 결합합니다..

인슐린 UKD

UKD 약물의 피하 투여 (s / c)로 설탕 감소 효과는 평균 1/4 시간 후에 빠르게 나타납니다. 호르몬의 함량은 1 ~ 3 시간 내에 최고점에 도달합니다. 조치 기간은 5 시간을 초과하지 않습니다. 이러한 약물에는 인슐린 리스프로, 아스 파트, 글루 리신이 포함됩니다..

Lispro는 분자에서 두 개의 아미노산을 재 배열하여 얻은 인간 호르몬의 DNA 재조합 유사체입니다. "Humalog"상표로 판매됩니다..

아스파르트를 얻기 위해 아미노산 프롤린을 제거하고 대신 아스파르트 산을 삽입합니다. 이 약은 "NovoRapid Penfill"등의 이름으로 판매됩니다..

글루 리신 생산에서 아스파라긴 (아미노산)은 아미노산 라이신으로 대체되고, 다른 위치의 라이신은 글루탐산으로 대체됩니다. 상표- "Apidra".

UKD 인슐린은 식사 직전에 사용할 수 있습니다..

인슐린 KD

이 인슐린은 중성 pH (6.6-8)의 완충 용액이기 때문에 가용성 인슐린이라고도합니다. 일반적으로 당뇨병 성 혼수 상태 및 전 혼수 상태에서 포도당 함량을 신속하게 줄여야 할 때뿐만 아니라 환자에게 최적의 용량을 설정할 때 병원 환경에서 사용됩니다..

피하 주사 결과는 30 분 후, 효과는 120 분 후 최대치에 도달하여 약 6 시간 지속됩니다. KD 제제는 또한 정맥 내 및 근육 내로 투여됩니다. 가용성 인슐린은 다음과 같은 유형으로 생산됩니다.

인간 유전 공학,

  • 인간 반합성,
  • 돼지 고기 단일 성분.
  • 첫 번째 유형에는 "휴 물린 레귤러"등이 포함됩니다..

반합성 수단은 "Biosulin R"등을 포함한다..

단일 성분 돼지 고기 준비 목록에는 "Actrapid MS"등이 포함됩니다..

인슐린 SD

그들은 이전 약물보다 더 느리게 흡수되므로 오래 지속되는 효과가 있습니다. 투여 후 치료 효과는 약 90 ~ 120 분에 나타나며 8 ~ 12 시간 지속됩니다..

이 약물에는 프로타민 (어유에서 추출한 단백질) 또는 아연이 포함되어 있습니다. NPH 인슐린 (아이 소판, Hagedorn의 중성 프로타민)은 프로타민과 인슐린의 현탁액입니다.

인슐린 이소 판은 돼지뿐만 아니라 인간, 반합성 및 유전자 조작입니다. 약품은 "Monodar B", "Gansulin N", "Biosulin N"등의 브랜드로 판매됩니다..

인슐린-아연 화합물 현탁액은 "Monotard MS"라는 이름으로 구입할 수 있습니다..

인슐린 DD

여기에는 glargine (Lantus) 및 detemir (Levemir Penfill 등)가 포함됩니다..

Glargin은 호르몬 분자의 두 가지 변형에 의해 생성됩니다. A- 사슬에서 21 번 위치의 아스파라긴이 글리신으로 대체되고, B- 사슬에서 아르기닌 잔기가 C- 말단에 부착됩니다..

Detemir는 사카로 미세 테스 (saccharomycetes) 계열의 단세포 현미경 진균을 사용하여 재조합 DNA 생명 공학에 의해 생산됩니다..

이러한 약물에 대한 노출 기간은 최대 36 시간입니다. 효과는 적용 후 4-8 시간 후에 시작됩니다..

이 약물에는 뚜렷한 피크 작용이 없습니다. 환자의 혈액에서 호르몬의 최대 농도가 관찰되는 기간. 일정한 속도로 활성 물질이 혈액으로 방출되기 때문에 유사한 효과가 달성됩니다..

이러한 약물은 한 번의 주사를 통해 하루 동안 혈당 조절을 보장한다는 점에서 편리합니다. 의약품은 근육 내 또는 피하로 투여되는 현탁액 형태로 생산됩니다..

DD 제제는 환자가 전 혼수 또는 혼수 상태에있을 때는 사용하지 않습니다. 산성 pH를 가지므로 중성 산도를 가진 KD 약물과 함께 사용할 수 없습니다..

복합 약물

약물은 인슐린 KD와 SD로 구성된 현탁액입니다. 이 조합을 사용하면 두 가지 유형의 약물을 사용해야하는 경우 한 번의 주사로 해결할 수 있습니다..

이상성 약물은 피부 아래 주사 30 분 후에 저혈당 효과를 나타냅니다. 효과의 지속 시간은 20 시간에 이릅니다. 이 약들은 Biogulin 70/30 등의 이름으로 판매됩니다..

지원 구성 요소

활성 물질 외에도 인슐린 제제에는 다양한 보조 요소가 포함되어 있습니다. 그들은 치료가 아니라 기술적입니다..

여기에는 다음이 포함됩니다.

  • 연장 제,
  • 항균 성분,
  • 안정제.

첫 번째는 활성 구성 요소의 지속 시간을 늘리기 위해 설계되었습니다..

항균 물질은 미생물 발생을 방지하여 약물의 수명을 연장합니다..

안정제는 약물의 산도 수준을 일정하게 유지합니다..

사용 된 추가 물질의 복합체는 다른 준비에서 동일하지 않습니다..

인슐린은 당뇨병 환자를 돕는 데 매우 중요합니다. 그러나 올바르게 적용되어야합니다. 약의 복용량은 환자의 상태 (포도당 수준, 인체 활동, 칼로리 섭취량, 인슐린에 대한 신체 반응 등)의 개별 특성을 고려하여 의사가 수행합니다. 약물 과다 복용은 혈류의 포도당 함량이 급격히 감소하여 사람이 저혈당 혼수 상태에 빠질 위험이 있다는 점에서 위험합니다.

인슐린 생산에 대한 자세한 내용은 비디오를 참조하십시오..

비디오에서 인슐린 주사를 올바르게하는 방법을 배울 수 있습니다.

유전 공학에 의한 인슐린 생산

인슐린 생산, 유전 공학, 생명 공학-교과 과정

함유량

1. 인슐린의 구조와 기능 5

1.1. 인슐린 5 분자 구조

1.2. 인슐린 7의 생물학적 중요성

1.3. 인슐린 생합성 8

2. 유전 공학에 의한 인슐린 합성 10

2.1. 약물 합성을위한 유전 공학 방법 적용 10

2.2. 유전 공학 기술 11

2.3. 유전 공학에 의한 인슐린 생산 14

본문에서 발췌

더욱이, 이들 두 성분은 융합 단백질의 조성에 동시에 존재할 수있다. 또한 하이브리드 단백질을 만들 때 다량 체의 원리를 사용할 수 있습니다. 하이브리드 단백질에 여러 개의 표적 폴리펩티드 사본이 존재하여 표적 제품의 수율을 크게 높일 수 있습니다..

영국에서 인간 인슐린의 두 사슬은 생물학적 활성 호르몬 분자에 연결된 대장균에 의해 합성되었습니다. 단세포 유기체가 리보솜에서 인슐린 분자를 합성하기 위해서는 필요한 프로그램, 즉 호르몬 유전자를 도입하는 것이 필요합니다.

재조합 인슐린은 유전자 조작 된 E. coli 균주를 사용하여 러시아 과학 아카데미 연구소에서 얻었습니다. 하이브리드 전구체 단백질은 성장한 바이오 매스에서 분리되며 양으로 표현됩니다.

40. 프리 프로 인슐린을 포함하는 총 세포 단백질에서.

시험관 내에서 인슐린으로의 변형은 생체 내에서와 동일한 순서로 수행됩니다. 선도적 인 폴리펩티드가 절단되고, 프리 프로 인슐린이 산화 적 황화 분해 단계를 통해 인슐린으로 전환 된 다음 3 개의 이황화 결합의 환원 적 폐쇄 및 결합 C- 펩티드의 효소 적 분리가 이어집니다. 이온 교환, 겔 및 HPLC 정제를 포함한 일련의 크로마토 그래피 정제 후 고순도 및 자연 활성의 인간 인슐린을 얻습니다..

인슐린을 얻기 위해 플라스미드에 염기 서열을 삽입 한 균주를 사용하여 선형 프로 인슐린과 단백질 단편 인 Staphylococcus aureus A로 구성된 융합 단백질을 N- 말단에 메티오닌 잔기를 통해 부착하여 발현시킨다 [8, 9, 10].

재조합 균주 세포의 포화 바이오 매스 배양은 융합 단백질 생산의 시작을 제공하며, 튜브에서 인슐린으로 이어지는 분리 및 순차 형질 전환.

또 다른 방법도 가능합니다. 박테리아 시스템에서 인간 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 부착 된 폴리 히스티딘 "꼬리"로 구성된 재조합 단백질의 발현을 확보하는 것입니다. Ni-agarose 컬럼에서 킬레이트 크로마토 그래피를 사용하여 분리하고 시아 노겐 브로마이드로 분해합니다..

분리 된 단백질은 S-sulfonated입니다. 음이온 교환기 및 RP (역상) 고성능 액체 크로마토 그래피에서 이온 교환 크로마토 그래피로 정제 된 수득 된 프로 인슐린의 매핑 및 질량 분석 분석은 천연 인간 프로 인슐린의 이황화 브릿지에 해당하는 이황화 브릿지의 존재를 보여줍니다..

최근에는 유전 공학 방법을 사용하여 재조합 인슐린을 얻는 절차를 단순화하는 데 세심한주의가 기울여지고 있습니다. 예를 들어 인터루킨의 리더 펩타이드의 라이신 잔기를 통해 N- 말단에 부착 된 프로 인슐린으로 구성된 단백질을 얻을 수 있습니다.

2. 단백질은 봉입체에서 효율적으로 발현되고 국소화됩니다. 분리 후, 단백질은 트립신에 의해 절단되어 인슐린과 C- 펩티드를 생성합니다 [5, 8, 10].

생성 된 인슐린 및 C- 펩티드를 RP HPLC로 정제 하였다. 융합 구조를 만들 때 운반 단백질의 질량과 표적 폴리펩티드의 비율은 매우 중요합니다..

C- 펩티드는 트립신에 의한 단백질의 후속 절단을 위해 Sfi I 제한 부위를 운반하는 아미노산 스페이서와 스페이서의 시작 및 끝에 두 개의 아르기닌 잔기를 사용하여 헤드-투-테일 원리에 따라 연결됩니다..

절단 생성물의 HPLC는 C- 펩티드의 절단이 정량적임을 나타내며, 이는 다량 체 합성 유전자의 방법을 사용하여 산업적 규모로 표적 폴리펩티드를 얻는 것을 가능하게한다..

결론

인슐린은 여전히 ​​급진적이며 대부분의 경우 당뇨병 환자의 수명과 업무 능력을 유지하는 유일한 수단입니다..

인슐린을 받아 임상에 도입하기 전, 질병 발병 후 1 ~ 2 년 이내에 제 1 형 진성 당뇨병 환자는 가장 피곤한 식단을 사용 했음에도 불구하고 치명적인 결과에 직면했습니다..

제 1 형 당뇨병 환자는 평생 인슐린 대체 요법이 필요합니다. 어떤 이유로 든 인슐린의 정기 투여를 중단하면 합병증이 급속히 진행되고 환자가 조기 사망하게됩니다..

현재 당뇨병은 심혈 관계 질환 및 악성 종양에 이어 유병률 측면에서 3 위를 차지하고 있습니다. 세계 보건기구에 따르면 세계 대부분의 지역에서 성인 인구의 당뇨병 유병률은 2 ~ 5 %이며 매번 증가하는 경향이 있습니다.

1. 년, 환자 수는 거의 두 배가되었습니다. 인슐린 의존 환자의 수는 건강 관리의 명백한 발전에도 불구하고 매년 증가하고 있으며 현재 러시아에서만 약 200 만 명입니다.

인슐린을 생산하는 가장 유망한 방법은 유전 공학 방법입니다. 유전자 조작 된 인슐린은 다른 생산자 균주를 사용하여 사슬 A와 B를 분리 생산하고 분자를 접은 다음 이소 형을 분리하고 트립신과 카르복시 펩티다아제에 의한 절단과 함께 대장균 세포에서 프로 인슐린을 합성하여 천연 인슐린을 얻습니다..

국내 유전자 조작 인간 인슐린 제제의 개발은 러시아의 당뇨병 문제를 해결하여 수백만 명의 당뇨병 환자의 생명을 구할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다..

문학

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1. 인슐린 분자의 이황화 결합 배열 다이어그램.

2. 인슐린 분자의 아미노산 잔기 배치

주요 대사 효소에 대한 인슐린의 영향

간 근육 지방 조직 활성화 1. 포스 포 디에스 테라 제 1. 포스 포 디에스 테라 제 1. LP- 리파제

4. 피루 베이트 탈수소 효소 복합체

4. 피루 베이트 탈수소 효소 복합체

5. 글리코겐 합성 효소와 글리코겐 인산화 효소의 포스파타제

5. 글리코겐 합성 효소의 포스파타제 b. 아세틸 CoA 카르 복실 라제 유도 1. 글루코 키나제 1. 글리 세르 알데히드 포스페이트 탈수소 효소

6. Glucose-6-phosphate dehydrogenase 억제 Phosphoenolpyruvate carboxykinase

그림: 3 Langerhans 섬의 β- 세포에서 인슐린 생합성의 도식. ER-소포체. 1-신호 펩티드의 형성; 2-프리 프로 인슐린의 합성; 3-신호 펩티드의 절단; 4-프로 인슐린을 골지체로 운반; 5-프로 인슐린의 인슐린 및 C- 펩티드로의 전환 및 인슐린 및 C- 펩티드의 분비 과립으로의 통합; 6-인슐린 및 C- 펩티드 분비.

4. 전구 물질로부터 인슐린 합성의 일반적인 계획

그림: 5 두 개의 분리 된 사슬을 형성하여 인슐린 합성

문학

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10. Romanchikov, A.B. 유전자 조작 된 인간 인슐린. 이중 기능성의 원리를 사용하여 크로마토 그래피 분리의 효율성을 개선합니다. / A.B. Romanchikov [및 기타]

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11. Rybchin VN 유전 공학의 기초 // VN Rybchin / 2nd ed, revised. 그리고 추가 : 대학을위한 교과서. SPb. : SPbSTU의 출판사. -2002.-522 초.

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14.www.biotechnolog.ru/ge/ge 31.htm

17.www. gmo-compass.org

유전자 조작 된 인간 인슐린 생산 방법

본 발명은 생명 ​​공학 분야, 즉 당뇨병 치료에 사용되는 약물의 제조를위한 유전자 조작 된 인간 인슐린을 얻는 것에 관한 것입니다..

이 방법은 인간 프로 인슐린, 대장균 BL21 / pPINS07 (BL07) 또는 대장균 JM109 / pPINS07을 포함하는 융합 단백질의 균주 생산자를 배양하고, 세포를 분해하여 파괴하고, 융합 단백질을 포함하는 봉입체를 분리하여 수행됩니다..

다음으로 봉입체의 예비 세척, 단백질의 동시 용해 및 5-10mM dithiothreitol 및 1mM EDTA가있는 완충액에서 이황화 결합 복원, 이온 교환 크로마토 그래피에 의한 재생 하이브리드 단백질의 재생 및 정제.

융합 단백질의 절단은 융합 단백질, 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B 4000 : 0.6 : 0.9의 질량비로 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B와의 결합 가수 분해에 의해 수행됩니다..

인슐린 정제는 소수성 크로마토 그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피에 이어 겔 여과에 의해 수행되고 인슐린 분리는 아연 염의 존재하에 결정화에 의해 수행됩니다. 본 발명은 유전자 조작 인간 인슐린을 얻는 과정을 줄이고 그 생산량을 증가시킬 수 있습니다..

본 발명은 생명 ​​공학 분야, 즉 당뇨병 치료에 사용되는 약물의 제조를위한 유전자 조작 된 인간 인슐린을 얻는 것에 관한 것입니다..

현대 당뇨병 학의 주요 성과와 세계 보건기구의 권고를 고려하여 2001 년까지 유럽 국가들은 인간 인슐린 사용으로의 전환을 완료했습니다. 이와 관련하여 DNA 재조합 기술을 이용한 인슐린 생산 방법 개발이 시급한 과제이다..

포도상 구균 단백질 A의 2 개의 합성 IgG 결합 도메인의 서열을 포함하는 프로 인슐린을 생산하는 생산자 균주 E. Coli의 배양으로 구성된 유 전적으로 조작 된 인간 인슐린을 생산하는 알려진 방법.

이 방법은 박테리아 세포의 파괴, 프로 인슐린을 포함하는 봉입체의 생산, 봉입체의 용해, 프로 인슐린의 산화 적 황화 분해, 재생, 친 화성 크로마토 그래피에 의한 재생 단백질의 정제, 단백질 분해 효소 (트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B)에 의한 프로 인슐린의 절단 및 고효율 역상 인슐린-액체로 구성됩니다. 크로마토 그래피 (Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "인간 인슐린과 그 C 펩티드의 통합 생산", Journal of biotechnology, 1996, v. 48, p. 241-250).

이 방법의 단점은 제품의 높은 비용과 인슐린 생산에 세제를 사용한다는 것입니다. 이는 표적 제품에 존재할 수 있습니다..

생산자 균주 E의 세포를 배양하는 것으로 구성된 유전자 조작 인간 인슐린을 생산하는 알려진 방법이 있습니다..

Coli DN5 a / pVK100, 초음파 분해에 의해 박테리아 세포 파괴, 원심 분리에 의해 수용성 불순물로부터 융합 단백질을 함유하는 봉입체를 분리하고, 봉입체를 8M 요소, 1mM 디티 오 트레이 톨, 0.1M Tris-HCl을 포함하는 버퍼에 용해, pH 8.0, 12-16 시간 이내.

불용성 불순물은 원심 분리에 의해 제거되고, 그 후 디티 오 트레이 톨의 농도가 10mM으로 증가하고 이황화 결합이 37 ° C에서 1 시간 동안 감소됩니다. 용액을 냉수로 5 배 희석하고 pH를 4.5로 조정하고 4 ° C에서 2 시간 동안 배양하여 침전물을 형성합니다..

융합 단백질을 포함하는 침전물은 원심 분리로 분리하고 재생하여 pH 10-12의 냉수에 빠르게 용해시킨 다음 10mM 글리신 완충액 (pH 10.8)으로 희석하고 밤새 4 ° C에서 보관합니다. 한외 여과 후 용액을 Sephadex G-50 컬럼에서 겔 여과하고 10mM 글리신 완충액으로 용출.

하이브리드 단백질을 포함하는 분획을 수집하고 한외 여과 및 동결 건조를 수행합니다. 생성 된 융합 단백질을 0.08 M Tris-HCl 완충액, pH 7.5에서 10 mg / ml의 농도로 용해시키고 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B (카르복시 펩 티다 제 B : 트립신 : 융합 단백질 비율 0.3 : 1:10)와 동시에 37에서 절단합니다. ° C 30 분.

그런 다음 이소프로판올을 40 %까지 추가합니다. 혼합물을 DEAE-Sephadex A-25 컬럼에서 크로마토 그래피 정제하고 0.05 M Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 40 % 이소프로판올로 용리하고 선형 염화나트륨 구배가 0 ~ 0.1m 인 이소프로판올 제거 후 염화나트륨의 농도 25 %로 증가, pH를 2.0으로 이동 및 인슐린 침전물 수집.

(Chen J.-Q., Zhang H.-T., Hu M.-H., Tang J.-G.,“E. Coli 시스템에서 met-lys-human proinsulin이 발현 된대로 인간 인슐린의 생산 전구체 "Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p.5-15).

이 방법의 단점은 초기 단계에서 겔 여과를 사용하는 것인데, 이는 상당한 양의 흡착제와 하이브리드 단백질의 절단에 사용되는 많은 효소를 필요로합니다..

대장균 JM109 / pPINS07의 생산자 균주의 배양, 분해에 의한 세균 세포 파괴, 융합 단백질을 함유하는 봉입체의 분리, 요소 및 디티 오 트레이 톨을 함유하는 완충액에서의 용해, 재생성 및 재생성에 의한 융합 단백질의 정제를 포함하는, 유전자 조작 된 인간 인슐린을 생산하는 공지 된 방법 40 % 이소프로판올에 불순물 화합물을 침전시킨 다음 KM- 세 파로스에서 크로마토 그래피, 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B로 순차 절단, 트립신 분해 생성물은 0.03-0.1M 암모늄 아세테이트 완충액 pH 5로 평형화 된 SP- 세 파로스에서 크로마토 그래피, 0-6.0, 6M 우레아 함유, 시작 완충액에서 0에서 0.5M의 염화나트륨의 선형 구배로 단백질 용출 및 카르복시 펩 티다 제 B로 절단 후 얻은 인슐린 분획은 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP HPLC)로 정제됩니다. 이어서 겔 여과 (특허 RF No. 2141531, MKI S12R 21/02, publ 엘. 1999g)

이 방법의 단점은 하이브리드 단백질의 정제 단계에서 상당한 양의 요소와 유기 용매를 사용한다는 것입니다..

당뇨병 전문가

인슐린을 사용하기 전에 당뇨병 환자의 기대 수명은 10 년을 넘지 않았습니다. 이 약의 발명은 수백만 명의 환자를 구했습니다. 인간의 유전자 조작 인슐린은 과학의 최신 성과입니다.

수년간의 노력의 결과

역사

유전자 조작 (재조합) 약물이 발명되기 전에 인슐린은 소와 돼지의 췌장에서 분리되었습니다..

돼지 인슐린과 인간 인슐린의 차이는 단 하나의 아미노산입니다

이 약을 얻는 방법의 단점 :

  • 생물학적 원료의 저장 및 운송의 복잡성;
  • 가축 부족;
  • 췌장 호르몬의 방출 및 정화와 관련된 어려움;
  • 알레르기 반응을 일으킬 위험이 높음.

1982 년 생물 반응기에서 천연 인간 인슐린이 합성되면서 새로운 생명 공학 시대가 시작되었습니다. 인슐린 요법이 시작될 때 과학자들의 목표가 환자의 생존뿐이라면, 요즘은 신약 개발이 질병에 대한 안정적인 보상을 달성하는 것을 목표로합니다. 과학 연구의 주요 목표는 당뇨병 환자의 삶의 질을 향상시키는 것입니다..

현대 기술

준비 방법에 따른 준비 유형 :

유전자 조작 된 재조합생산을 위해 유전자 변형 E. coli가 사용됩니다.

  • 알레르기 반응 부족;
  • 생산 수익성;
  • 고도의 정화.
유전 학자들이 가장 좋아하는-대장균
유전자 조작 수정출발 물질은 돼지 인슐린입니다. 그것은 유 전적으로 변형됩니다..호르몬 구조
인조인공 합성 약물, 그 구성은 인간 인슐린과 완전히 동일합니다..약물 생산

약물 투여 후 신체에서 일어나는 일?

인슐린은 세포막 수용체와 연결되어 다음과 같은 과정을 수행하는 복합체를 형성합니다.

  1. 세포 내 포도당 수송을 개선하고 흡수를 촉진합니다..
  2. 포도당 처리에 관여하는 효소의 방출을 촉진합니다.
  3. 간에서 글리코겐 형성 속도 감소.
  4. 지방과 단백질 대사를 자극합니다.

피하 투여의 경우 인슐린은 20 ~ 25 분 안에 효과가 나타납니다. 약물 작용의 지속 시간은 5-8 시간입니다. 나중에 인슐린 효소 효소에 의해 분해되어 소변으로 배설됩니다. 약물은 태반을 통과하지 않고 모유로 전달되지 않습니다..

유전자 조작 인슐린은 언제 처방됩니까??

긴급한 도움이 필요한 경우

유전자 조작 된 인간 인슐린은 다음과 같은 경우에 사용됩니다.

  1. 당뇨병 1 형 또는 2 형. 독립적 인 치료 또는 다른 약물과 함께 사용.
  2. 경구 포도당 저하제에 대한 내성.
  3. 임산부의 당뇨병.
  4. 신장과 간에서 합병증이있는 경우.
  5. 지속성 인슐린으로 전환 할 때.
  6. 수술 전 기간.
  7. 생명을 위협하는 상태 (고 삼투압 또는 케톤 산성 혼수 상태)가 발생한 경우.
  8. 응급 상황 (출산 전, 부상시).
  9. 영양 장애 피부 병변 (궤양, furunculosis)이있는 경우.
  10. 감염 배경에 대한 당뇨병 치료.

인간의 유전자 조작 인슐린은 내약성이 우수하고 천연 호르몬과 완전히 동일하기 때문에 알레르기 반응을 일으키지 않습니다..

지속적인 모니터링이 중요합니다!

다음과 같은 경우 약을 처방하는 것은 금지되어 있습니다.

  • 혈당 수치 낮추기;
  • 약물에 과민 반응.

약물 처방 후 첫날에는 환자를주의 깊게 관찰해야합니다..

부작용

두드러기 위험! Quincke의 부종!

드물게 인슐린을 사용할 때 다음과 같은 합병증이 발생할 수 있습니다.

  • 알레르기 반응 (두드러기, Quincke의 부종, 가려운 피부);
  • 혈당의 급격한 감소 (신체에 의한 약물 거부로 인해 또는 면역 학적 충돌의 경우 발생);
  • 의식 장애;
  • 심한 경우에는 저혈당 혼수 상태가 발생할 수 있습니다.
  • 갈증, 구강 건조, 무기력, 식욕 감소;
  • 고혈당증 (감염이나 발열의 배경에 대해 약물을 사용할 때);
  • 얼굴의 발적;
  • 투여 부위의 국소 반응 (화상, 가려움증, 위축 또는 피하 지방 조직의 과다 성장).

때때로 약물에 대한 적응은 부종 및 시각 장애와 같은 장애를 동반합니다. 이러한 증상은 보통 몇 주 후에 사라집니다..

약국에서 유전자 조작 인슐린을 찾는 방법?

이 약은 비경 구 투여 용 솔루션 형태로 제공됩니다.

"비오스 린"평균 행동 시간
"Actrapid"속효성 인슐린
"겐 술린"이상성 약물 (단기 및 중기 작용 인슐린의 조합)
"린 슐린"빠른 효과
"휴말 로그"주사기 펜을 사용하여 약을 주입합니다.

환자의 개별적인 특성을 고려하여 인슐린 제제를 선택하는 것은 어렵지 않습니다..

이용 약관

피하 인슐린이 가장 일반적으로 사용됩니다..

긴급한 경우에는 약을 정맥으로 투여합니다..

환자가 심각한 상태에있는 경우

경험이있는 당뇨병 환자라도 약물 사용시 실수를 할 수 있습니다..

합병증을 방지하려면 다음을 수행해야합니다.

  1. 사용하기 전에 약의 유효 기간을 확인하십시오.
  2. 보관 권장 사항 준수 : 예비 바이알은 냉장고에 보관해야합니다. 개봉 한 병은 어두운 곳에서 상온 보관 가능.
  3. 올바른 복용량을 잘 기억하십시오. 의사의 처방전을 다시 읽으십시오..
  4. 주입하기 전에 주사기에서 공기를 방출하십시오..
  5. 피부는 깨끗해야하지만 약물의 효과를 떨어 뜨리기 때문에 가공에 알코올을 사용하는 것은 바람직하지 않습니다..
  6. 최적의 주사 부위를 선택하십시오. 복부 피부 아래에 주사하면 약물이 더 빨리 작용합니다. 인슐린은 둔부 주름이나 어깨에 주사 할 때 더 천천히 흡수됩니다..
  7. 전체 표면적을 사용하십시오 (국소 합병증의 발생 방지). 주사 사이의 거리는 2cm 이상이어야합니다..
  8. 근육이 갇힐 위험을 줄이기 위해 주름을 잡은 피부를 캡처합니다..
  9. 약이 새지 않도록 주사기를 피부 아래에 비스듬히 주입하십시오..
  10. 복부 주사의 경우, 속효성 인슐린은 식사 20 분 전에 투여해야합니다. 어깨 나 엉덩이를 선택하는 경우-식사 30 분전.

다른 약물과의 병용

종종 당뇨병 환자는 여러 가지 약물을 복용합니다. 다른 약물과의 조합은 유전자 조작 인슐린의 치료 효과에 영향을 미칠 수 있습니다..

합병증을 예방하려면 다음 사항을 알아야합니다.

혈당을 낮추어 유전자 조작 인슐린의 효과를 높입니다.
  • 설폰 아미드.
  • MAO 억제제 (푸라 졸리 돈).
  • ATP 억제제 (캅토 프릴).
  • 비 스테로이드 성 항염증제 (디클로페낙, 아스피린).
  • 안드로겐.
  • 말라리아 예방 약물 (퀴니 딘).
  • 단백 동화 스테로이드.
  • 테트라 사이클린 항생제 (독시사이클린).
  • 테오필린.
  • 모르핀.
요로 감염 치료에 사용되는 인기 약물 Doxycycline
인슐린 작용 감소
  • 글루코 코르티코이드 (프레드니손, 하이드로 코르티손).
  • 에스트로겐 함유 경구 피임약.
  • 이뇨제.
  • 암페타민.
  • 갑상선 호르몬.
  • Sympathomimetics (아드레날린, 메자 톤, 도파민).
  • 글루카곤.
주의하세요!

과다 복용

어떤 경우에는 인슐린 투여로 인해 혈당 수치가 갑자기 떨어집니다. 문제는 종종 약물 복용량의 잘못된 선택으로 인해 발생합니다..

저혈당증의 초기 증상 :

  • 약점;
  • 피부의 창백함;
  • 불안 상태;
  • 현기증;
  • 방향 감각 상실;
  • 손, 발, 혀 및 입술의 무감각;
  • 떨리는 사지;
  • 식은 땀;
  • 굶주림에 대한 강한 느낌;
  • 두통.

떨림 웰빙의 갑작스런 악화

이러한 증상이 나타나면 쉽게 소화 할 수있는 탄수화물이 함유 된 음식을 빨리 먹어야합니다. 이것은 쿠키, 사탕, 설탕 또는 흰 빵이 될 수 있습니다. 달콤한 차는 그러한 상황에서 잘 도움이됩니다..

상태가 악화되면 구급차를 불러야합니다. 저혈당증은 환자의 혼수 상태 또는 사망을 초래할 수 있습니다..

의사에게 자주 묻는 질문

임신 중 유전자 조작 인슐린 사용

안녕하세요 Snezhana. 인간의 유전자 조작 인슐린은 태반을 통과하지 않으며 임신 중에 완전히 안전합니다. 복용량을 조정하려면 내분비 전문의를 만나야합니다.

재조합 인슐린은 위험합니까??

여보세요! 재조합 인슐린은 천연 인슐린과 다르지 않습니다. 그것을 얻기 위해 유전자 변형 박테리아가 사용됩니다..

유전 공학 기술의 도움으로 인슐린 유전자를 포함하는 재조합 DNA가 대장균 세포에 이식됩니다. 유전자 변형 유기체는 번식하여 호르몬을 생성합니다. 이 제품은 매우 효과적이며 고도로 정제되었습니다..

인슐린. 파트 II. 미생물 인슐린 생산

친 화성 성분-융합 단백질의 분리를 크게 촉진.

더욱이,이 두 성분은 융합 단백질의 구성에 동시에 존재할 수 있습니다.

또한, 하이브리드 단백질을 생성 할 때 다량 체의 원리를 사용할 수 있으며 (즉, 하이브리드 단백질에 여러 개의 표적 폴리펩티드 사본이 존재 함) 표적 생성물의 수율을 크게 증가시킬 수 있습니다..

2 E. coli 세포에서 proinsulin의 발현..

[6]에서 저자는 플라스미드에 염기 서열이 삽입 된 JM 109 N1864 균주를 사용하여 선형 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 N- 말단에 부착 된 황색 포도상 구균 단백질 A 단편으로 구성된 융합 단백질을 발현했습니다..

재조합 균주 세포의 포화 바이오 매스 배양은 융합 단백질 생산의 시작을 제공하며, 튜브에서 인슐린으로 이어지는 분리 및 순차 형질 전환.

또 다른 연구 그룹 [3]은 인간 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 부착 된 폴리 히스티딘 꼬리로 구성된 박테리아 발현 시스템에서 융합 재조합 단백질을 얻었습니다. 봉입체에서 Ni-agarose [7] 컬럼에서 킬레이트 크로마토 그래피를 사용하여 분리하고 시아 노겐 브로마이드로 분해했습니다..

저자는 분리 된 단백질이 S- 설 폰화됨을 확인했습니다..

음이온 교환기 및 RP (역상) HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)상의 이온 교환 크로마토 그래피로 정제 된 수득 된 프로 인슐린의 매핑 및 질량 분광 분석은 천연 인간 프로 인슐린의 이황화 가교에 해당하는 이황화 가교의 존재를 보여주었습니다. 연구 [8]는 원핵 세포에서 유전 공학 방법으로 인간 인슐린을 생산하는 새롭고 개선 된 방법의 개발에 대해보고합니다. 저자들은 얻은 인슐린이 췌장에서 분비되는 호르몬과 구조 및 생물학적 활성이 동일하다는 것을 발견했습니다..

최근에는 유전 공학 방법을 사용하여 재조합 인슐린을 얻는 절차를 단순화하는 데 세심한주의가 기울여지고 있습니다. 이에 저자들은 [9]에서 라이신 잔기를 통해 프로 인슐린의 N- 말단에 부착 된 인터루킨 2의 리더 펩타이드로 구성된 융합 단백질을 얻었다..

단백질은 봉입체에서 효율적으로 발현되고 국소화되었습니다. 분리 후, 단백질을 트립신으로 절단하여 인슐린과 C- 펩티드를 생성 하였다. 다른 연구자 그룹 [10]은 비슷한 방식으로 행동했습니다..

프로 인슐린과 IgG에 결합하는 포도상 구균 단백질 A의 2 개의 합성 도메인으로 구성된 융합 단백질은 봉입체에 국한되었지만 더 높은 수준의 발현을 나타 냈습니다. 단백질은 IgG를 사용한 친 화성 크로마토 그래피로 분리하고 트립신과 카르복시 펩 티다 제 B로 처리했습니다..

생성 된 인슐린 및 C- 펩티드를 RP HPLC로 정제 하였다. 융합 구조를 만들 때 운반 단백질과 표적 폴리펩티드의 질량 비율이 매우 중요합니다..

따라서 연구 [11]는 인간 혈청 알부민과 결합하는 단백질이 운반체 폴리펩티드로 사용되는 융합 구조의 구성을 설명합니다. 1 개, 3 개 및 7 개의 C- 펩티드가 부착되었습니다..

C- 펩티드는 단백질의 후속 트립신 절단을 위해 스페이서의 시작 및 끝에 Sfi I 제한 부위 및 2 개의 아르기닌 잔기를 보유하는 아미노산 스페이서를 사용하여 헤드-투-테일 방식으로 연결되었다. 절단 생성물의 HPLC는 C- 펩티드의 절단이 정량적으로 진행됨을 보여 주었고, 이는 산업적 규모로 표적 폴리펩티드를 얻기 위해 다량 체 합성 유전자의 방법을 사용할 수있게한다..

[12]에서는 Arg32Tyr 치환을 포함하는 프로 인슐린 돌연변이 체의 제조에 대해 설명했습니다. 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B와이 단백질의 공동 절단은 티로신 잔기를 포함하는 천연 인슐린 및 C- 펩티드의 형성을 초래했습니다. 후자는 125I로 라벨링 한 후 방사성 면역 분석에 적극적으로 사용됩니다. 3 인슐린 정제.

의약품 제조용 인슐린은 순도가 높아야합니다. 따라서 생산의 모든 단계에서 생성 된 제품의 순도를 매우 효과적으로 제어해야합니다. 이전에는 RP 및 IO (이온 교환) HPLC를 사용하여 프로 인슐린 -S- 설포 네이트, 프로 인슐린, 개별 A- 및 B- 사슬과 S- 설포 네이트를 특성화했습니다 [13].

또한 형광 인슐린 유도체에 특별한주의를 기울입니다 [14]. 연구 [6]에서 저자는 인간 인슐린 생산의 모든 단계의 제품 분석에서 크로마토 그래피 방법의 적용 가능성과 정보 성을 조사하고 얻은 제품을 효과적으로 분리하고 특성화 할 수있는 크로마토 그래피 작업 절차를 작성했습니다..

[15]의 저자는이기 능성 흡착제 (소수성 및 이온 교환 RP HPLC)를 사용하여 인슐린 유도체를 분리하고 각 상호 작용의 기여도를 다양 화하여 분리 선택성을 제어 할 수있는 가능성을 보여 주어 밀접한 단백질 유사체의 분리에서 더 높은 효율성을 달성했습니다..

또한 인슐린의 순도와 양을 결정하는 프로세스를 자동화하고 가속화하기위한 접근법이 개발되고 있습니다..

이 연구는 인슐린 측정을 위해 전기 화학적 검출과 함께 RP 액체 크로마토 그래피를 사용할 수있는 가능성에 대한 연구를보고하고 있으며, 분 광학적 검출과 함께 면역 친 화성 크로마토 그래피에 의해 랑게르한스 섬에서 분리 된 인슐린을 측정하기위한 방법이 개발되었습니다 [17]..

연구 [18]는 레이저 형광 검출과 함께 모세관 전기 영동을 사용하여 인슐린의 빠른 미세 결정을 사용할 수있는 가능성을 조사했습니다. 분석은 알려진 양의 페닐 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 표지 인슐린과 인슐린에 대한 단일 클론 항체의 Fab 단편을 샘플에 첨가하여 수행됩니다. 라벨이 붙은 기존 인슐린은 Fab와 복합체를 형성하기 위해 경쟁합니다. FITC 표지 인슐린과 Fab와의 복합체는 30 초 안에 분리됩니다..

최근에는 인슐린을 생산하는 방법을 개선하고 인슐린을 기반으로 한 제형을 만드는 데 많은 연구가 이루어졌습니다..

예를 들어, 미국에서 특허받은 간특 이적 인슐린 유사체 [19]는 A- 사슬의 13-15 및 19 번 위치와 B- 사슬의 16 번 위치에 다른 아미노산 잔기가 도입되어 구조적으로 자연 호르몬과 다릅니다..

얻어진 유사체는 다양한 비경 구 (정맥 내, 근육 내, 피하), 비강 내 투여 형태 또는 당뇨병 치료에 특수 캡슐 형태의 이식에 사용됩니다. 주사없이 투여되는 제형의 생성은 특히 관련이 있습니다..

연구 [20]는 경구 투여를위한 거대 분자 시스템의 생성에 대해보고합니다.이 시스템은 단백질 분해 효소의 억제제로 변형 된 폴리머 하이드로 겔 부피에 인슐린이 고정되어 있습니다. 이러한 약물의 효과는 피하 주사 된 천연 인슐린 효과의 70-80 %입니다..

또 다른 연구 [21]에서 약물은 결합제의 존재하에 1-4 : 100의 비율로 취해진 적혈구와 인슐린의 1 단계 배양에 의해 얻어집니다. 저자는 1000 단위 / g의 활성을 가진 약물의 수령, 동결 건조 형태로 수년간 경구 투여 및 보관 후 활성 유지를보고합니다..

인슐린을 기반으로 한 신약 및 제형의 개발 외에도 당뇨병 문제를 해결하기위한 새로운 접근 방식이 개발되고 있습니다..

따라서 [22]의 저자는 이전에 HEP G2 ins의 전체 길이 인슐린 cDNA로 안정적으로 형질 감염된 포도당 수송 단백질 GLUT2의 cDNA를 형질 감염 시켰습니다..

얻어진 HEP G2 Insgl 클론에서 포도당은 정상적인 인슐린 분비에 가깝게 자극하고 다른 분비 자극 자에 대한 분비 반응을 강화합니다.

면역 전자 현미경은 랑게르한스 섬의 b 세포에있는 과립과 형태 학적으로 유사한 인슐린을 포함하는 과립을 밝혀냈다. 현재 제 1 형 진성 당뇨병의 치료를 위해 유전 공학 방법으로 얻은 "인공 b 세포"를 사용할 가능성이 심각하게 논의되고 있습니다..

실용적인 문제를 해결하는 것과 함께 인슐린의 작용 메커니즘과 분자의 구조적 및 기능적 관계를 연구합니다. 연구 방법 중 하나는 다양한 인슐린 유도체의 생성과 이의 물리 화학적 및 면역 학적 특성에 대한 연구입니다 [23, 24].

위에서 언급 한 바와 같이, 인슐린 생산을위한 많은 방법은 전구체 (프로 인슐린) 형태의이 호르몬 생산에 기초한 다음 인슐린 및 C- 펩티드에 대한 효소 적 절단을 기반으로합니다. 현재 C-peptide에 대한 생물학적 활성의 존재가 밝혀져 인슐린과 함께 치료 목적으로 사용할 수 있습니다..

이 시리즈의 다음 기사에서는 C- 펩티드의 이화 학적 및 생물학적 특성과 그 제조 방법을 고려할 것입니다..

의약품 생산의 생명 공학

STGch의 20K 버전을 얻기위한 흥미로운 개발. 유망한 작업은 호르몬의 장기간 작용을 얻기 위해 다양한 형태의 STH뿐만 아니라 고정 된 STH를 얻고 연구하는 것입니다. 장기간 작용으로 고정 된 STHch를 얻는 독창적 인 방법이 개발되었습니다. [4].

STH의 생산과 병행하여 모든 종 특이 적 호르몬과 HTG의 일부 변형을 포함하여 선 저하 수체의 호르몬 생산을위한 독창적 인 복잡한 기술이 만들어졌습니다. 매우 중요한 것은 유전 공학 방법으로 얻은 STH (somatogen)의 치료 제제 생성을위한 목표 프로그램의 구현입니다..

임상 경험에 따르면 저신장의 치료를 최적화하는 동안 다양한 기술 또는 방법 (SCh, ausomatin, somatogen)으로 얻은 여러 유사한 의약품을 무기고에 보유하는 것이 좋습니다..

하나의 STHH 약물로 장기간 치료 (수년간)하면 신체의 민감도가 감소합니다..

이것은 부분적으로 항체 형성의 결과 일 수 있지만 근본 원인은 수용체 수준과 호르몬 처리에서 찾아야합니다. [2]

HTS와 함께 일하면서 분비 된 호르몬과 그 다양한 형태에 대한 포괄적 인 연구를 통해 자연에서 생성 된 시스템을 연구하고 더 잘 이해할 수 있습니다. 신체에 다양한 기본 형태의 STHC가 존재한다는 것은 예를 들어 클리닉에서 그 가능성과 가능한 사용을 나타냅니다..

STHH의 새로운 제제를 만들 때, 우선 천연 호르몬의 천연 형태에 초점을 맞추고 적절한 경우 STHH 모노머와 마찬가지로 유전 공학에 의해 크기를 조정해야합니다..

GTC에서 STHH 제제를 생산할 때 선 저하증의 다른 호르몬 (LGH, FSHH, TSHH 등)을 생산하기위한 복잡한 산업 기술이 성공적으로 구현되었습니다. 새로운 프로그레시브 방법 (친 화성 크로마토 그래피 등)을 도입하여 생산을 최적화해야합니다..

); 복잡한 기술을 사용하여 고순도 호르몬을받습니다..

고정화 된 것을 포함하여 STHH의 새로운 제제를 만들기 위해서는 진단 및 생명 공학을위한 선 저하 수체 호르몬의 면역 미세 분석 세트의 생산 및 사용을 확대하고, 다양한 범위의 표준화 된 항체의 규제 된 생산을 수행해야합니다. [2]

STH가 단백질, 지방, 무기질 대사에 영향을 미치고, 표적 기관없이 세포 수준에서 작용하며, 단백 동화라는 사실은 배상 과정을 자극하고 다양한 질병을 치료하는 데 사용할 수있는 가능성이 높습니다. 이러한 문제에 대한 광범위한 연구와 STHC의 다양한 변형 된 형태 및 변형을 사용할 가능성은 시급하고 유망한 작업입니다. [2]

생명 공학 분야의 인슐린 생산

췌장에있는 랑게르한스 섬의 펩타이드 호르몬 인 인슐린은 당뇨병의 주요 치료법입니다. 이 질병은 인슐린 결핍으로 인해 발생하며 혈당 수치의 증가로 나타납니다. 최근까지 인슐린은 소와 돼지의 췌장에서 얻었습니다..

이 약물은 인간 인슐린과 1-3 개의 아미노산 치환이 달랐기 때문에 특히 어린이들에게 알레르기 반응의 위협이있었습니다. 인슐린의 대규모 치료 사용은 높은 비용과 제한된 자원으로 인해 제한되었습니다..

화학적 변형에 의해 동물의 인슐린은 인간과 구별 할 수 없게되었지만 이는 제품 가격의 추가 상승을 의미했습니다. [8]

1982 년부터 EliLilly는 E. coli A 및 B 사슬의 개별 합성을 기반으로 유전자 조작 된 인슐린을 생산해 왔습니다. 제품 비용이 크게 감소했으며 얻은 인슐린은 인간과 동일합니다. 1980 년 이후, 제한된 단백질 분해를 통해 성숙한 형태로 변하는 호르몬의 전구체 인 프로 인슐린 유전자의 복제에 대한 언론 보도가있었습니다..

캡슐화 기술은 당뇨병 치료에도 적용됩니다. 캡슐의 췌장 세포가 환자의 몸에 한 번 주입되어 1 년 동안 인슐린을 생성합니다..

Integrated Genetics는 난포 자극 및 황체 형성 호르몬을 출시했습니다. 이 펩티드는 두 개의 하위 단위로 구성됩니다. 의제는 신경계의 올리고 펩티드 호르몬 (5 개 아미노산 잔기로 구성된 엔케팔린, 엔돌핀, 모르핀 유사체)의 산업적 합성 문제입니다..

이 펩타이드를 합리적으로 사용하면 통증 완화, 기분 전환, 효율성 증가,주의 집중, 기억력 향상, 수면 및 각성 정리.

유전 공학 방법의 성공적인 적용의 예는 다른 펩티드 호르몬 인 소마토스타틴에 대해 위에서 설명한 하이브리드 단백질 기술을 사용하여 β- 엔돌핀을 합성하는 것입니다. [7]

인간 인슐린을 얻는 방법 :

역사적으로, 치료 목적으로 인슐린을 얻는 첫 번째 방법은 천연 공급원 (소와 돼지의 췌장 섬)에서이 호르몬 유사체를 분리하는 것입니다..

지난 세기의 20 년대에 소 및 돼지 인슐린 (구조 및 아미노산 서열에서 인간 인슐린에 가장 가까운 인슐린)이 인간 인슐린에 필적하는 인체에서 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후 오랫동안 소 또는 돼지 인슐린을 사용하여 1 형 당뇨병 환자를 치료했습니다..

그러나 잠시 후 많은 경우 소 및 돼지 인슐린에 대한 항체가 인체에 축적되기 시작하여 그 효과가 무효화되는 것으로 나타났습니다..

한편, 인슐린을 생산하는이 방법의 장점 중 하나는 인간 인슐린을 생산하는 첫 번째 방법의 개발에 결정적인 역할을 한 원료 (소 및 돼지 인슐린을 대량으로 쉽게 얻을 수 있음)의 가용성입니다. 이 방법을 반합성이라고합니다. [아홉]

이 인간 인슐린 생산 방법에서는 돼지 인슐린을 원료로 사용했습니다. B- 사슬의 C- 말단 옥타 펩티드는 정제 된 돼지 인슐린으로부터 절단 된 후 인간 인슐린의 C- 말단 옥타 펩티드가 합성되었습니다.

그런 다음 화학적으로 부착하고 보호를 해제하고 생성 된 인슐린을 정제했습니다. 인슐린을 얻기 위해이 방법을 시험 할 때, 얻은 호르몬과 인간 인슐린의 완전한 동일성이 나타났다.

이 방법의 가장 큰 단점은 인슐린 생산 비용이 높다는 것입니다 (지금도 옥타 펩티드의 화학적 합성은 특히 산업적 규모에서 값 비싼 즐거움입니다).

현재 인간 인슐린은 주로 합성 효소 방법과 유전 공학 방법으로 돼지 인슐린을 변형시키는 두 가지 방법으로 얻습니다..

첫 번째 경우,이 방법은 돼지 인슐린이 B- 사슬 Ala30Thr의 C- 말단에서 하나의 치환에 의해 인간 인슐린과 다르다는 사실을 기반으로합니다..

알라닌을 트레오닌으로 대체하는 것은 효소 촉매 작용을 통해 알라닌을 절단하고 반응 혼합물에 과량으로 존재하는 카르 복실 보호 트레오닌 잔기를 그 자리에 첨가함으로써 수행됩니다. 보호 O-tert- 부틸 그룹의 절단 후 인간 인슐린이 얻어집니다..

인슐린은 재조합 DNA 기술을 사용한 최초의 상용 단백질이었습니다. 유전자 조작 된 인간 인슐린을 얻기위한 두 가지 주요 접근법이 있습니다..

첫 번째 경우, 분리 된 (다른 생산자 균주) 분자의 후속 폴딩 (이황화 가교 형성) 및 동형의 분리로 두 사슬을 모두 얻습니다..

두 번째로, 전구체 (프로 인슐린)의 형태로 얻은 다음 트립신과 카르복시 펩 티다 제 B를 사용하여 활성 형태의 호르몬으로 효소 절단.

현재 가장 바람직한 것은 전구체 형태의 인슐린 생산이며, 이황화 가교의 정확한 폐쇄를 보장합니다 (사슬의 개별 생산의 경우 연속적인 변성주기, 이소 형 분리 및 재생이 수행됨). [아홉]

두 가지 방법 모두 초기 구성 요소 (A- 쇄 및 B- 쇄 또는 프로 인슐린)를 개별적으로 획득하고 융합 단백질의 일부로 얻을 수 있습니다. A- 및 B- 사슬 또는 프로 인슐린 외에도 융합 단백질에는 다음이 포함될 수 있습니다.

1) 운반 단백질-융합 단백질을 세포 또는 배양 배지의 주변 세포질 공간으로 수송하는 것;

2) 친 화성 성분-융합 단백질의 분리를 크게 촉진.

더욱이,이 두 성분은 융합 단백질에 동시에 존재할 수 있습니다. 또한 융합 단백질을 생성 할 때 다량 체의 원리를 사용할 수 있으며 (즉, 융합 단백질에 여러 개의 표적 폴리펩티드 사본이 존재 함) 표적 생성물의 수율을 크게 높일 수 있습니다. [십]

E. coli 세포에서 프로 인슐린의 발현..

우리는 선형 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 N- 말단에 부착 된 황색 포도상 구균 단백질 A 단편으로 구성된 융합 단백질을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 삽입 한 균주 JM 109 N1864를 사용했습니다..

재조합 균주 세포의 포화 바이오 매스 배양은 융합 단백질 생산의 시작을 제공하며, 튜브에서 인슐린으로 이어지는 분리 및 순차 형질 전환.

또 다른 연구 그룹은 인간 프로 인슐린과 메티오닌 잔기를 통해 부착 된 폴리 히스티딘 꼬리로 구성된 박테리아 발현 시스템에서 융합 재조합 단백질을 받았습니다. Ni-agarose 봉입체에서 킬레이트 크로마토 그래피를 사용하여 분리하고 시아 노겐 브로마이드로 분해했습니다..

저자는 분리 된 단백질이 S- 설 폰화됨을 확인했습니다..

음이온 교환기 및 RP (역상) HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)상의 이온 교환 크로마토 그래피로 정제 된 수득 된 프로 인슐린의 매핑 및 질량 분광 분석은 천연 인간 프로 인슐린의 이황화 가교에 해당하는 이황화 가교의 존재를 보여주었습니다. 원핵 세포에서 유전 공학 방법으로 인간 인슐린을 생산하는 새롭고 개선 된 방법의 개발도보고되었습니다. 저자들은 얻은 인슐린이 췌장에서 분비되는 호르몬과 구조 및 생물학적 활성이 동일하다는 것을 발견했습니다. [13]

최근에는 유전 공학 방법을 사용하여 재조합 인슐린을 얻는 절차를 단순화하는 데 세심한주의가 기울여지고 있습니다. 따라서, 라이신 잔기를 통해 프로 인슐린의 N- 말단에 부착 된 인터루킨 리더 펩티드로 구성된 융합 단백질이 수득되었다. 단백질은 봉입체에서 효율적으로 발현되고 국소화되었습니다..

분리 후, 단백질을 트립신으로 절단하여 인슐린과 C- 펩티드를 생성 하였다. 다른 연구자 그룹도 비슷한 방식으로 행동했습니다. 프로 인슐린과 포도상 구균으로부터 얻은 단백질 A의 2 개의 합성 도메인으로 구성된 융합 단백질로, 봉입체에 국한되어 있지만 더 높은 수준의 발현을 가짐.

단백질은 IgG를 사용한 친 화성 크로마토 그래피로 분리하고 트립신과 카르복시 펩 티다 제 B로 처리했습니다. 생성 된 인슐린과 C- 펩티드는 RP HPLC로 정제되었습니다. 융합 구조를 만들 때 운반 단백질과 표적 폴리펩티드의 질량 비율이 매우 중요합니다..

이것은 인간 혈청 알부민 결합 단백질이 담체 폴리펩티드로 사용 된 융합 구조물의 구성을 설명합니다. 1 개, 3 개 및 7 개의 C- 펩티드가 부착되었습니다..

C- 펩티드는 단백질의 후속 트립신 절단을 위해 스페이서의 시작 및 끝에 Sfi I 제한 부위 및 2 개의 아르기닌 잔기를 보유하는 아미노산 스페이서를 사용하여 헤드-투-테일 방식으로 연결되었다. 절단 생성물의 HPLC는 C- 펩티드의 절단이 정량적으로 진행됨을 보여 주었고, 이는 산업적 규모로 표적 폴리펩티드를 얻기 위해 다량 체 합성 유전자의 방법을 사용할 수있게한다..

Arg32Tyr 치환을 포함하는 프로 인슐린 돌연변이를 얻습니다. 트립신 및 카르복시 펩 티다 제 B와이 단백질의 공동 절단은 티로신 잔기를 포함하는 천연 인슐린 및 C- 펩티드의 형성을 초래했습니다. 후자는 125I로 라벨링 한 후 방사성 면역 분석에 적극적으로 사용됩니다. [십사]

인슐린 정제.

의약품 제조용 인슐린은 순도가 높아야합니다. 따라서 생산의 모든 단계에서 생성 된 제품의 순도를 매우 효과적으로 제어해야합니다. 이전에는 RP 및 IO (이온 교환) HPLC를 사용하여 프로 인슐린 -S- 설포 네이트, 프로 인슐린, 개별 A- 및 B- 사슬과 S- 설포 네이트를 특성화했습니다 [13].

또한 형광 인슐린 유도체에 특별한주의를 기울입니다 [14]. 이 연구에서 저자는 인간 인슐린 생산의 모든 단계의 제품 분석에서 크로마토 그래피 방법의 적용 가능성과 정보 성을 조사하고 제품의 효율적인 분리 및 특성화를 허용하는 크로마토 그래피 작업 절차를 작성했습니다..

저자는이기 능성 흡착제 (소수성 및 이온 교환 RP HPLC)를 사용하여 인슐린 유도체를 분리하고 각 상호 작용의 기여도를 변경하여 분리 선택성을 제어 할 수있는 가능성을 보여 주어 가까운 단백질 유사체의 분리에서 더 높은 효율성을 달성했습니다..

또한 인슐린의 순도와 양을 결정하는 프로세스를 자동화하고 가속화하기위한 접근법이 개발되고 있습니다..

이 논문은 인슐린 측정을 위해 전기 화학적 검출과 함께 RP 액체 크로마토 그래피를 사용할 가능성에 대한 연구를보고하고 있으며, 분 광학적 검출을 통한 면역 친 화성 크로마토 그래피에 의해 랑게르한스 섬에서 분리 된 인슐린을 측정하는 방법이 개발되었습니다..

이 연구는 레이저 형광 검출과 함께 모세관 전기 영동을 사용하여 인슐린의 신속한 미세 결정을 사용할 가능성을 조사했습니다. 분석은 알려진 양의 페닐 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 표지 인슐린과 인슐린에 대한 단일 클론 항체의 Fab 단편을 샘플에 첨가하여 수행됩니다. 라벨이 붙은 기존 인슐린은 Fab와 복합체를 형성하기 위해 경쟁합니다. FITC 표지 인슐린 및 Fab와의 복합체는 30 초 내에 분해됩니다. [12]

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복수


수면 중에 신체는 깨어있을 때와는 완전히 다른 작업 방식으로 재건됩니다. 대중적인 믿음과는 달리 그는 현재 휴식을 취하지 않습니다. 뇌는 사람의 안녕을 제어하고 꿈을 꾸며, 내부 기관은 심장 박동, 호르몬 생성, 호흡 등 모든 중요한 기능을 지원합니다..그러나 일부 사람들의 경우 수면 중에 신체의 정상적인 기능이 중단 될 수 있습니다.

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